【JACS】类药环肽开发新标准
2024-06-17
细胞内许多信号通路通过蛋白-蛋白相互作用（Protein-Protein Interactions, PPIs）起作用，这通常涉及较大且平坦的疏水结合表面。相比传统的小分子和抗体，中等尺寸的环肽更适合用于细胞内以及缺乏小分子结合深腔的靶点。它们通常比传统的小分子更大，分子量在1000-2000 g/mol之间，并且能够在其一小部分分子上展现出类似抗体的结合亲和力和特异性。这解释了大环多肽抑制剂能够表现出高选择性和较少脱靶副作用的原因。环肽也能保持许多理想的小分子特性，如低免疫原性和抗蛋白水解降解等。
然而，除了Lipinski的药五原则（Rule of Five），人们对分子量大于500 g/mol的中等尺寸环肽的药物性质缺乏系统性的了解。因此，目前筛选出的多肽类先导化合物往往在药物性质方面表现不佳，在后续的药物性质优化过程中，存在活性丧失的风险。中外制药株式会社（下称中外制药）针对这一问题，通过详细阐述类药环肽的结构特征和理化性质，系统性总结环肽药物性质的潜在参考标准，对多肽药物研发者具有一定借鉴意义。中外制药通过其构建的环肽文库，成功针对细胞内一度被认为是不可靶向的靶点KRAS，设计并获得了具有强效口服潜力的环肽。近日，该研究工作发表在美国化学会出版的Journal of the American Chemical Society期刊（J. Am. Chem. Soc. 2023, 145 (44), 23891-24436）【1】。
首先，为了在不大幅修改骨架的情况下获得足够的生物活性和药物相似性，作者参考了已上市药物环孢素（Cyclosporine）的结构特征，设计并合成了环肽文库（见图1）。他们的研究旨在探讨环孢素是否在药物性质方面为特例，以及如果不是特例，是否存在一些肽特有的结构特征使其具备药物性质。文库中的环肽由天冬氨酸侧链的N端胺和羧酸或其C端衍生物连接而成。总体上，该文库具有如下多样性分布：氨基酸残基8-12个、N-烷基化0-8个、Clog P为4.4-15.2、羟基0或1个、分子量为845-1499 g/mol。
图1、环肽先导化合物的设计思路及文库构建
本文将“药物性质”定义为可接受的代谢稳定性和膜渗透性，并分别用体外肝微粒体实验和Caco-2渗透性实验对文库中的肽进行评估。初步评估表明，含有11个残基的环肽符合药物性质标准的比例最高。此外，作者进一步发现，Clog P大于12.9和N-烷基化多于6个对药物性质具有显著贡献（见图2）。在极性和带电基团方面，研究结果表明，存在3个羟基或一个带电基团会显著降低环肽的膜渗透性。最终，作者证实了上述筛选得到的药物环肽确实具有较好的口服生物利用度和体内分布，从而强化了前述结论的可靠性。
图2、不同结构特征环肽药物性质评估
对上述药物肽的研究表明，这些药物肽需要具备不同于已报道的环肽库中的特征，例如高度烷基化、酰胺环化、强疏水性、适当的肽长度以及受限的侧链极性等。换言之，优异药物性质的环肽文库与已有的环肽建库方法存在显著差异。基于这一认识，作者设计构建体外翻译体系（In Vitro Translation, IVT），以期获得具有良好药物性质的环肽。这需要解决两个问题，其一是N-烷基化氨基酸的连续插入。通过对比，作者最终采用了pCpA方法而非pdCpA法（原因见图3ABC），并通过对每个氨酰tRNA合成酶进行突变，将N-烷基化氨基酸的连续插入效率提高至80%以上。其二是实现代谢稳定的成环策略。作者通过采用还原脱除正交保护基以及类似于天然化学偶联（Native Chemical Ligation, NCL）的成环反应（见图3D），成功解决了上述问题。
图3、特征环肽库构建策略
利用上述IVT体系，作者建立了具有良好药物性质的mRNA展示文库，并以KRAS为模型蛋白进行筛选。所得环肽与KRAS的亲和力为0.3-2.9 μM，其中，先导化合物AP8784对KRAS与SOS1之间的PPI表现出良好的抑制效果，IC50值为180 nM（见图4）。
图4、先导化合物AP8784结构及抑制活性数据
最后，作者对AP8784进行了一些结构优化，得到了活性更优的化合物LUNA18（见图5）。LUNA18对各种KRAS突变体均具有超强的亲和力，KD最低可达31 pM。对于多种KRAS-G12X突变的癌细胞系，LUNA18亦表现出nM级别的抑制效果。
图5、化合物LUNA18结构及细胞活性数据
小结：综上所述，通过文库分析，作者详尽阐明了药物环肽的结构特征和理化性质，为药物环肽的开发提供了新的参考数据。在此基础上，作者成功建立了一种具有较高药物性质环肽的mRNA展示技术。最终在针对细胞内靶点KRAS的研究中，发现了活性优异的先导环肽AP8784，并通过改良获得了具有强效可口服的环肽LUNA18。根据文中的药代动力学数据，小鼠、大鼠、犬、猴均表现出低清除率，进一步改善吸收可能有望提高生物利用度。这些结果表明，LUNA18这种环肽具有成为口服药物的治疗潜力。目前，LUNA18正在日本和美国开展一期临床试验。
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